ΣΕ ΑΥΤΗΝ ΤΗΝ ΣΕΛΙΔΑ

    1. Τι είναι η κρυοσυντήρηση ωοκυττάρων
    2. Πότε ενδείκνυται
    3. Αρχές κρυοσυντήρησης ωοκυττάρων
    4. Δομή του ωοκυττάρου
    5. Βλάβες σχετιζόμενες με την κρυοσυντήρηση
    6. Ψύξη σε διάφορα στάδια
    7. Αργή ψύξη: Ορισμός και τεχνικές λεπτομέρειες
    8. Υαλοποίηση: Ορισμός και τεχνικές λεπτομέρειες
    9. Σύγχρονες τάσεις κρυοσυντήρησης

Τι είναι η κρυοσυντήρηση ωοκυττάρων

Η συντήρηση των ωοκυττάρων για μεγάλα χρονικά διαστήματα είναι ένας από τους πιο φιλόδοξους στόχους της σύγχρονης ιατρικής και εμβρυολογίας. Η κρυοσυντήρηση ωοκυττάρων των θηλαστικών άρχισε το 1958, όταν παρουσιάστηκε για πρώτη φορά η ψύξη και η απόψυξη ωοκυττάρων ποντικών.

Μετά από 20 χρόνια μελέτης της κρυοβιολογίας, το 1977 αναφέρθηκε η πρώτη επιτυχημένη εξωσωματική γονιμοποίηση ωοκυττάρων ποντικών καθώς και ζωντανοί απόγονοι. Μεταγενέστερα, σχετικά επιτυχής κρυοσυντήρηση ωοκυττάρων επιτεύχθηκε και για διάφορα άλλα είδη όπως το ινδικό χοιρίδιο, ο λαγός, το γουρούνι, η γάτα και η αγελάδα.

Όσων αφορά την κρυοσυντήρηση ανθρώπινων ωοκυττάρων το πρώτο περιστατικό αναφέρθηκε το 1986 . Ωστόσο τα ποσοστά εγκυμοσύνης ήταν πολύ χαμηλά μέχρι τα τέλη της δεκαετίας του 1990. Με αργούς ρυθμούς οι μέθοδοι της «αργής ψύξης» και της «υαλοποίησης (vitrification) » επέδειξαν μια σταθερή βελτίωση των ποσοστών γονιμοποίησης και εγκυμοσύνης. Τα τελευταία  χρόνια η τεχνολογία της υποβοηθούμενης αναπαραγωγής έχει συμβάλει στην αύξηση των επιτυχημένων ποσοστών της κρυοσυντήρηση.

Ενδείξεις

  1. Καρκινοπαθείς

Η πιο σημαντική χρήση της συντήρησης ωοκυττάρων σχετίζεται με τη διατήρηση της γονιμότητας των προεμμηνοπαυσιακών καρκινοπαθών που υποβάλλονται σε θεραπείες που οδηγούν σε στείρωση. Η χημειοθεραπεία, ειδικά οι αλκυλοποιητικοί παράγοντες, και η ακτινοθεραπεία μπορούν να προκαλέσουν πρώιμη βλάβη των ωοθηκών, αφήνοντας την ασθενή ανήμπορη να τεκνοποιήσει.

Τα βελτιωμένα ποσοστά επιβίωσης στις περιπτώσεις καρκίνου ωοθηκών καθώς και η επιθυμία των νέων γυναικών να δημιουργήσουν οικογένεια έχει προβάλει την κρυοσυντήρηση ωοκυττάρων ως μια βιώσιμη λύση όταν η θεραπεία του καρκίνου μπορεί να καθυστερήσει για 2 με 3 εβδομάδες, που χρειάζονται για τη δοκιμασία και τη διέγερση για να ανακτηθούν τα ωοκύτταρα.

  1. Ασθενείς που θα υποβληθούν σε μεταμόσχευση μυελού των οστών (BMT)  ή μεταμόσχευσηstemcells (STC)

Ασθενείς με λευχαιμία και άλλες μη κακοήθεις παθήσεις υποβάλλονται σε μεγάλες δόσεις χημειοθεραπείας και ακτινοθεραπείας πριν το BMT  ή STC.  Δυστυχώς, τα αποτελέσματα αυτής της αγωγής οδηγούν σε βλάβη των ωοθηκών στην πλειονότητα των ασθενών.

  1. Ωοθηκεκτομή για καλοήθεις όγκους των ωοθηκών, ενδομητρίωση ή προληπτική αμφοτερόπλευρη ωοθηκεκτομή

Αυτές οι διαδικασίες καθιστούν τις ασθενείς  ανήμπορες να τεκνοποιήσουν.

  1. Καθυστέρηση απόκτησης απογόνων

Στις σημερινές κοινωνίες οι γυναίκες τείνουν να καθυστερούν την απόκτηση απογόνων για προσωπικούς ή επαγγελματικούς λόγους. Ως αποτέλεσμα πολλές από αυτές επιλέγουν να κάνουν παιδιά στην 5η δεκαετία της ζωής τους, όταν η γονιμότητα έχει ήδη μειωθεί (η γήρανση των ωοκυττάρων σχετίζεται πρωτίστως, αν όχι εντελώς, με τη ηλικία). Η κρυοσυντήρηση των ωοκυττάρων προσφέρει στις γόνιμες γυναίκες την δυνατότητα να ψύξουν τα δικά τους ωοκύτταρα και να επιλέξουν την ηλικία μητρότητας οι ίδιες.

  1. Ηθική αντίθεση στην κρυοσυντήρηση εμβρύων

Υπάρχουν κοινωνίες όπως η ιταλική και ζευγάρια που αντιτίθενται  στην κρυοσυντήρηση εμβρύων. Η κρυοσυντήρηση ωοκυττάρων προσφέρει μια εναλλακτική λύση γιατί είναι ηθικά λιγότερο δύσκολο να απορριφθούν τα ωοκύτταρα σε σχέση με τα έμβρυα σε περίπτωση μη χρησιμοποίησης.

  1. Δωρεά ωοκυττάρων

Τα τελευταία χρόνια η δωρεά ωοκυττάρων χρησιμοποιείται ευρέως ειδικά στις Η.Π.Α. Η κρυοσυντήρηση ωοκυττάρων μπορεί να προσφέρει μια πιο βολική λύση σε προβλήματα χρόνου και τόπου. Το κόστος μπορεί επίσης να μειωθεί καθώς τα ωοκύτταρα από μία δότρια θα μπορούσαν να μοιραστούν σε περισσότερες λήπτριες (‘eggsharing’).

Αρχές κρυοσυντήρησης ωοκυττάρων

Ο τελικός στόχος της κρυοσυντήρησης ωοκυττάρων είναι η διατήρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων μετά την αποθήκευση για μεγάλο χρονικό διάστημα. Για να επιτευχθεί αυτό τα ωοκύτταρα πρέπει να οδηγηθούν σε μία κατάσταση ανασταλμένης κινητικότητας και να επιστρέψουν στη πρότερη βιώσιμη κατάσταση κάποια στιγμή στο μέλλον. Η θερμοκρασία του υγρού αζώτου (-196οC) φαίνεται να είναι η κατάλληλη για αυτό το σκοπό.

Στη θερμοκρασία αυτή ,που μπορεί να επιτευχθεί είτε με αργή ψύξη είτε με γρήγορη ψύξη (‘υαλοποίηση-vitrification’), το νερό υπάρχει μόνο σε κρυσταλλική μορφή και όλες οι γνωστές βιολογικές αντιδράσεις έχουν σταματήσει. Μόνος κίνδυνος θεωρείται η αποσύνθεση του DNA που προκαλείται από την κοσμική ακτινοβολία, αν και τα ανθρώπινα κύτταρα μπορούν να επιζήσουν για εκατοντάδες ή χιλιάδες χρόνια χωρίς βλάβες από την ακτινοβολία αυτή.

Τρεις κύριοι στόχοι της κρυοσυντήρησης:

  1.  Αποφυγή δημιουργίας κρυστάλλων πάγου
    Όταν το νερό ψύχεται κάτω από το σημείο πήξης του, στερεοποιείται  σε μια κρυσταλλική δομή (πάγος). Οι κρύσταλλοι πάγου καταλαμβάνουν μεγαλύτερο όγκο από το υγρό από το οποίο σχηματίζονται, γεγονός που προκαλεί πίεση και δυνάμεις διάτμησης στα ενδοκυττάρια οργανίδια.
  2. Αποφυγή λύσης (solution)
    Η συγκέντρωση των ηλεκτρολυτών και άλλων διαλυμένων σωμάτων (solutes) μπορεί να φτάσει σε πολύ υψηλά επίπεδα όταν υπερισχύει η στερεή μορφή. Αυτές οι συγκεντρώσεις μπορεί να είναι πολύ τοξικές για τις ενδοκυττάριες πρωτεΐνες.
  3. Αποφυγή του ωσμωτικού σοκ
    Κατά την επαναφορά της θερμοκρασίας, ο πάγος τήκεται και το νερό κυριαρχεί στο κύτταρο, προκαλώντας αύξηση της ωσμωτικότητας. Όταν η αύξηση της θερμοκρασίας είναι αργή, υπάρχει ο κίνδυνος τήξης και επανακρυσταλλοποίησης του νερού που προκαλεί περαιτέρω βλάβη. Όταν η αύξηση της θερμοκρασίας είναι ταχεία, η απότομη πτώση της εξωκυττάριας ωσμωτικής πίεσης μπορεί να οδηγήσει σε μεγάλες μεταβολές του ελεύθερου ύδατος εντός και εκτός του κυττάρου οδηγώντας σε διόγκωσηση και κυτταρική βλάβη.

 Όλες οι τεχνικές κρυοσυντήρησης χρησιμοποιούν χημικές ουσίες για να αποφευχθεί η κυτταρική βλάβη. Οι ουσίες αυτές ονομάζονται  «κρυοπροστατευτικοί παράγοντες» και χωρίζονται σε 2 κατηγορίες:  διαπεραστικές και μη διαπεραστικές.

  • Οι διαπεραστικοί κρυοπροστατευτικοί παράγοντες είναι μικρά μόρια τα οποία διαπερνούν τις μεμβράνες των κυττάρων και σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου με τα μόρια νερού αποτρέποντας την δημιουργία κρυστάλλων.
  • Αντίθετα οι μη διαπεραστικοί κρυοπροστατευτικοί παράγοντες παραμένουν στον εξωκυττάριο χώρο. Αυτοί δρουν τραβώντας το νερό εξωκυττάρια αφυδατώνοντας τον ενδοκυττάριο χώρο.

Δομή του ωοκυττάρου

Δύο στάδια των ωοκυττάρων είναι σημαντικά στην κρυοσυντήρηση.

  1. §         Τα ανώριμα ωοκύτταρα στο στάδιο του βλαστικού κυστιδίου περιέχουν ένα μεγάλο διπλοειδή πυρήνα (πρόφαση Ι), μία πυκνή δέσμη από ινώδη ακτίνη υποκείμενη στην κυτταρική μεμβράνη και διάφορα άλλα οργανίδια διασκορπισμένα στο κυτταρόπλασμα όπως μιτοχόνδρια, ενδοπλασματικό δίκτυο και συσκευή Golgi. Η συσκευή Golgiτου ωοκυττάρου παράγει κυστίδια σαν λυσοσώματα, τα φλοιϊκά κοκκία , τα οποία τυχαία διανέμονται μέσα στο κυτταρόπλασμα.
  2. Ώριμα ωοκύτταρα (μετάφαση της 2ης μιτωτικής διαίρεσης ΜΙΙ) χαρακτηρίζονται από μία μεγάλη περιφερική συσκευή ατράκτου, εκτεινόμενη από πόλο σε πόλο και από κάθε πόλο στους κινητοχώρους των χρωμοσωμάτων που είναι στοιχισμένα κατά μήκος του μεταφασικού πιάτου. Δεν υπάρχουν εμφανή κεντριόλια στη μειωτική άτρακτο αλλά η συσκευή διαθέτει κάποιο παρακεντριολικό υλικό που λειτουργεί ως οργανωτικό κέντρο για τον πολυμερισμό της τουμπουλίνης σε κάθε πόλο κατά τη διάρκεια του σχηματισμού της ατράκτου. Μικρονημάτια, τα οποία καθοδηγούν την κατανομή των οργανιδίων και την εξώθηση του πολικού σωματίου κατά τη μείωση, διανέμονται γύρω από τον πυρήνα και το φλοιϊκό κυτταρόπλασμα. Η μετανάστευση των φλοιϊκών κοκκίων στην περιφέρεια του κυτταροπλάσματος προετοιμάζει το ωοκύτταρο για την εξωκύτωση τη στιγμή της γονιμοποίησης.

 

Θεόδωρος Καλαμπόκας Γυναικολόγος

Ο Dr Θ. Καλαμπόκας είναι ειδικός στη στη Γυναικολογική Ενδοκρινολογία, Εξωσωματική Γονιμοποίηση, Υστεροσκόπηση, Ενδοσκόπηση

Δείτε το βιογραφικό μου

Επικοινωνήστε μαζί μου

 

 

Βλάβες σχετιζόμενες με την κρυοσυντήρηση

Η κυτταρική επιβίωση διακυβεύεται κυρίως κατά τη διάρκεια της αρχικής φάσης της ψύξης και της τελικής επαναφοράς στη θερμοκρασία δωματίου. Η μακροπρόθεσμη αποθήκευση σε χαμηλή θερμοκρασία δεν έχει επίδραση στα ποσοστά επιβίωσης επειδή σ’ αυτή τη θερμοκρασία οι φυσιολογικές αντιδράσεις σταματούν και τα μόρια του νερού σχηματίζουν μια κρυσταλλική δομή.

Πιθανή βλάβη των ωοκυττάρων κατά την κρυοσυντήρηση

Κατά την ψύξη, οι διαφορετικές ωσμωτικές πιέσεις ανάμεσα στον ενδοκυττάριο και τον εξωκυττάριο χώρο προκαλούν γρήγορη μεταφορά του νερού διαμέσου της πλασματικής μεμβράνης του ωοκυττάρου. Η ωσμωτική κλίση οδηγεί σε έλξη νερού από το κυτταρόπλασμα στο εξωκυττάριο μέσο και το κύτταρο συρρικνώνεται. Αν η διαδικασία είναι αρκετά αργή, η μαζική μεταφορά νερού έξω από το κύτταρο θα μειώσει την πιθανή εμπυρήνωση του πάγου μέσα στο κύτταρο μέχρι τους -15οC. Για μεγάλα κύτταρα με μικρό κλάσμα επιφάνειας προς όγκο, όπως τα ωοκύτταρα, ο αργός ρυθμός ψύξης είναι απαραίτητος για την έξοδο επαρκούς ποσότητας νερού από το ωοκύτταρο.

Κατ’ αυτό τον τρόπο, οι ενδοκυττάριοι κρύσταλλοι πάγου που σχηματίζονται θα είναι αρκετά μικροί για να αποφευχθεί βλάβη στις ενδοκυττάριες δομές. Από την άλλη η υαλοποίηση, που παρέχει μια γρήγορη πτώση της θερμοκρασίας κατά τη μεταβατική φάση μπορεί να μειώσει το θερμικό στρες και επακόλουθα τη βλάβη από την ψύξη.

Αποδόμηση της μειωτικής ατράκτου

Η μειωτική άτρακτος αποτελείται από μικροσωληνίσκους, αποτελούμενους από α και β διμερή τουμπουλίνης, οι οποίοι συνεχώς μεταβάλουν την κατάσταση ισορροπίας μεταξύ της ελεύθερης και της πολυμερισμένης μορφής. Η μειωτική συσκευή επηρεάζεται πολύ από τη ψύξη και τους κρυοπροστατευτικούς παράγοντες.

 Όσον αφορά στην ψύξη η μειωτική άτρακτος επηρεάζεται τόσο από τη θερμοκρασία όσο και από τη διάρκεια της έκθεσης σε αυτήν. Έρευνες σε ποντίκια έδειξαν μερική αποδόμηση της μειωτικής ατράκτου μετά από ψύξη στους 25οCκαι πλήρη αποδόμηση στους 4οC. Όσον αφορά τους κρυοπροστατευτικούς παράγοντες, η άτρακτος επηρεάζεται πολύ από τη συγκέντρωσή τους. Η προπανεδιόλη (PROH) σε χαμηλές δόσεις ως 1Μ προκαλούν αποδιοργάνωση της μειωτικής ατράκτου των ωοκυττάρων των ποντικών αλλά η δράση γίνεται σταθεροποιητική σε μεγαλύτερες δόσεις (1,5-2,0 Μ). Από την άλλη το διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) (1,5Μ) στους 37οCπροκαλεί σχηματισμό πολλαπλών αστέρων  τουμπουλίνης που τελικά οδηγούν σε αποδόμηση της ατράκτου.

Αν η άτρακτος είναι τελείως διαταραγμένη, η εξώθηση του δεύτερου πολικού σωματίου δυσχεραίνεται και η συνέπεια είναι πολυπλοειδία. Μια βλάβη της ατράκτου σε μικρότερο βαθμό μπορεί να οδηγήσει σε ανευπλοειδία, σχετιζόμενη με άνιση κατανομή των χρωμοσωμάτων  και των χρωματίδων. Ωστόσο η δράση αυτή είναι πλήρως αντιστρεπτή μετά την επαναθέρμανση στους 37οCγια μία ώρα.

Ο Ριάντσι και οι συνεργάτες του ανέφεραν επανεμφάνιση της ατράκτου σε όλα τα επιζήσαντα ωοκύτταρα μετά από αργή ψύξη και κατέληξαν ότι όλοι οι άτρακτοι που παρατηρήθηκαν στα αποψυγμένα ωοκύτταρα ήταν αποτελεσμα επανακατασκευής μετά τη θέρμανση. Περαιτέρω ενθαρρυντικά δεδομένα έδωσε ο Γκουκ και οι συνεργάτες, ο οποίος απέδειξε πως δεν υπάρχει καμία αύξηση στον αριθμό των ανωμαλιών όταν γίνεται χρήση  ωοκυττάρων που έχουν υποστεί κρυοσυντήρηση. Σε άλλη μελέτη,  δεν ανιχνεύτηκε καμία αναπτυξιακή ή διανοητική διαταραχή σε κανένα από τα 16 παιδιά που γεννήθηκαν από κρυοσυντηρημένα ωοκύτταρα μετά από παρακολούθηση  3 χρόνων.

Μορφολογικό μειονέκτημα των μιτοχονδρίων και του ενδοπλασματικού δικτύου (ΕΔ)

Τα μιτοχόνδρια είναι χαρακτηριστικά μορφολογικά στοιχεία στα ανθρώπινα ωοκύτταρα. Είναι σφαιρικά και τυπικά περιέχουν μερικές κοντές παρυφές που σπάνια διαπερνούν μια άκρως πυκνή σε ηλεκτρόνια θεμέλιο ουσία. Θεωρούνται τα περισσότερο άφθονα  οργανίδια των ωοκυττάρων των θηλαστικών και η δυσλειτουργία τους μπορεί να είναι μοιραία για την ανάπτυξη του εμβρύου. Υψηλό ποσοστό των κρυοσυντηρημένων ωοκυττάρων (72%) έδειξαν μειωμένη ηλεκτρονιακή πυκνότητα της μήτρας ή/και απόσχιση των εξωτερικών και των εσωτερικών μεμβρανών.

Επιπρόσθετα, ωοκύτταρα με μιτοχονδριακή βλάβη, που είχαν υποστεί κρυοσυντήρηση και θέρμανση, χαρακτηρίζονται και από διόγκωση του ΕΔ. Η διαδικασία επηρεάζει την κατανομή των μιτοχονδρίων και των κοκκίων του ΕΔ, επηρεάζοντας είτε άμεσα τα σχετικά κυτταροσκελετικά στοιχεία είτε μέσω φυσικών δυνάμεων που σπάνε τις συνδέσεις με τον κυτταροσκελετό.

Περαιτέρω ανάλυση αποκαλύπτει ότι η αργή ψύξη επιφέρει μια μικροκενοτοπιώδη εξεργασία  και μια διόγκωση των ΕΔ κοκκίων. Λαμβάνοντας υπόψην αυτά τα δεδομένα, τα μιτοχόνδρια είναι ένας ιδιαίτερος στόχος της βλάβης από την ψύξη και ότι πρέπει να ελέγχονται κατά την ανάπτυξη των πρωτοκόλλων κρυοσυντήρησης.

Σκλήρυνση της Διαφανούς Ζώνης (ΖΡ)

Η ΖPείναι ένα γλυκοπρωτεϊνικό κάλυμμα που περιβάλλει το ωοκύτταρο και διαδραματίζει ένα σημαντικό ρόλο στην προστασία και τη ρύθμιση της γονιμοποίησης. Πρώιμη απελευθέρωση των φλοιιϊκών κοκκίων (ως αποτέλεσμα αύξησης στην συγκέντρωση του ασβεστίου) μπορεί να οδηγήσει σε σκλήρυνση της ζώνης που αποτρέπει τη διείσδυση των σπερματοζωαρίων στο ωοκύτταρο. Αντιστρόφως  μπορεί να προκληθεί βλάβη της ZPή μετανάστευση των φλοιικών κοκκίων  στο κέντρο του ωοκυττάρου, καταλήγοντας σε πολλαπλή είσοδο σπερματοζωαρίων και ανώμαλη γονιμοποίηση.

Μετά την εισαγωγή της ενδοκυτταροπλασματικής έγχυσης σπέρματος (ICSI) από τον Παλέρμο και τους συνεργάτες του το 1992, οι επιστήμονες μπορούν να παρακάμψουν  την σκληρυμένη ζώνη (εγχέοντας ένα μόνο σπερματοζωάριο) οδηγώντας σε βελτιωμένα ποσοστά γονιμοποίησης και ζωντανών γεννήσεων. Ωστόσο η σκλήρυνση της ZP μπορεί να έχει και άλλες επιπτώσεις στην ικανότητα του εμβρύου να «εκκολάψει» την ZPπριν την εμφύτευση στη μήτρα.

Πιθανή βλάβη μετά την κρυοσυντήρηση

 Επανακρυσταλλοποίηση και ωσμωτικό σοκ

Κατά τη διάρκεια της επαναθέρμανσης, ο πάγος λιώνει και απελευθερώνεται ελεύθερο ύδωρ , οδηγώντας σε μείωση της ωσμωτικότητας του περιβάλλοντος διαλύματος. Επανακρυσταλλοποίηση ονομάζεται η διαδικασία κατά την οποία το νερό επιστρέφει μέσα στο κύτταρο και προσλαμβάνει μια στερεή μορφή γύρω από μικρούς κρυστάλλους πάγου που έχουν σχηματισθεί πρωθύστερα στο κυτοσόλιο. Κατά την αργή τήξη, όταν η θερμοκρασία ανέβει στους -40οCμερικά μόρια νερού μπορεί να επιστρέψουν στο κυτοσόλιο  και να σχηματίσουν δεσμούς υδρογόνου με τους κρυστάλλους νερού που είναι ήδη παρόντες.

Αυτή η διαδικασία αυξάνει σημαντικά τις διαστάσεις του κυττάρου. Όταν η τήξη είναι ταχεία, ξαφνικές πτώσεις στην εξωκυττάρια ωσμωτική πίεση μπορεί να οδηγήσουν σε γρήγορες μεταβολές του ελεύθερου ύδατος κατά μήκος και εντός του κυττάρου, καταλήγοντας σε διόγκωση του και κυτταρική βλάβη λόγω ωσμωτικού σοκ. Αν ο κρυοπροστατευτικός παράγοντας που έχει διαπεράσει πρωθύστερα το κύτταρο δεν διαχυθεί έξω γρήγορα για να αποτρέψει την εισροή νερού, το ωοκύτταρο θα διογκωθεί και θα εκραγεί.

 Μόλυνση

Κατά τη διάρκεια της υαλοποίηση τα ωοκύτταρα τοποθετούνται σε μέσα που περιέχουν κρυοπροστατευτικές ουσίες και εκτίθενται άμεσα σε υγρό άζωτο. Διάφορα ανοιχτά συστήματα φορέων μπορούν να χρησιμοποιηθούν, συμπεριλαμβανομένων πλεγμάτων ηλεκτρονικού μικροσκοποίου, openpulledstrawsandcryoloops.

Τα ανοιχτά συστήματα φορέων απαιτούν άμεση επαφή μεταξύ του διαλύματος που περιέχει το ωοκύτταρο και του υγρού αζώτου αυξάνοντας την πιθανότητα μετάδοσης μικροβίων μέσω μολυσμένου αζώτου. Αρκετά μοντέλα για εντερο-ιό, βόειο ερπητοϊό 1 και βόειο ιό ανοσοανεπάρκειας έχουν χρησιμοποιηθεί για να μολύνουν πειραματικά το υγρό άζωτο. Ωστόσο μέχρι σήμερα καμιά ιϊκή ή βακτηριακή μόλυνση δεν έχει περιγραφεί σε σχεδόν 1500 δημοσιεύσεις σχετικές με την υαλοποίηση από το 1985 μέχρι το 2007.

Ελεύθερες ρίζες οξυγόνου (ROS)

Όχι μόνο η διαδικασία ψύξης αλλά και το invitroπεριβάλλον της τεχνολογίας υποβοηθούμενης αναπαραγωγής (ART) μετά την κρυοσυντήρηση μπορεί να είναι επικίνδυνα για τα ωοκύτταρα. Ελεύθερες ρίζες οξυγόνου μεταβάλλουν την ποιότητα και την αλληλεπίδραση των ωοκυττάρων. ROSστα μέσα καλλιέργειας μπορούν να επηρεάσουν την ανάπτυξη μετά τη γονιμοποίηση δηλαδή το ποσοστό διάσπασης , την απόδοση και την ποιότητα της βλαστοκύστης.  Ως εκ τούτου αντιοξειδωτικές στρατηγικές μπορεί να χρησιμοποιηθούν για να αναχαιτίσουν τις ενδοκυττάριες και τις εξωκυττάριες ROS.

Ψύξη σε διάφορα στάδια

Υπάρχουν διάφορες στρατηγικές όσον αφορά το στάδιο των ωοκυττάρων καθώς και τη συν-κρυοσυντήρηση των κυττάρων της θήκης. Η επικρατούσα μέθοδος προτείνει την κρυοσυντήρηση των ωοκυττάρων στο στάδιο της μετάφασης ΙΙ. Τα ποσοστά επιβίωσης μετά την κρυοσυντήρηση επηρεάζονται από το στάδιο μείωσης των ωοκυττάρων. Το ΜΙΙ ωοκύτταρο κινδυνεύει λόγω του μεγάλου μεγέθους του, της υψηλής περιεκτικότητάς του σε νερό και της διευθέτησης των χρωμοσωμάτων. Τα μεταφασικά χρωμοσώματα είναι στοιχισμένα μέσω της μειωτικής ατράκτου πάνω στο ισημερινό πιάτο. Αποδόμηση της μειωτικής ατράκτου κατά τη διαδικασία μπορεί να οδηγήσει σε χρωμοσωμικές παρεκκλίσεις.

Μια εναλλακτική λύση είναι η χρήση ωοκυττάρων που βρίσκονται στο βλαστικό στάδιο, τα οποία έχουν φτάσει στο μέγιστο μέγεθός τους και είναι ικανά για μείωση χωρίς όμως να έχουν συνεχίσει την ωρίμανση τους και να έχουν προχωρήσει στην ΜΙΙ. Έχει αναφερθεί ότι κατεψυγμένα ωοκύτταρα του βλαστικού σταδίου επιζούν σε μεγαλύτερο ποσοστό αυτών του σταδίου ΜΙΙ και έχουν μικρότερο ποσοστό ανωμαλιών. Το βλαστικό στάδιο δεν περιέχει μια κρυο-ευαίσθητη μειωτική άτρακτο, ωστόσο είναι πιο ευαίσθητο στην ψύξη λόγω της μικρότερης σταθερότητας της μεμβράνης και μια ιδιαίτερης κυτταροσκελετικής διαμόρφωσης.

Άλλο ένα ευαίσθητο σημείο είναι οι προβολές των κυττάρων της θήκης οι οποίες μπορεί να βλαφθούν ή να διακοπούν. Όσον αφορά την υαλοποίηση είναι καλύτερο να χρησιμοποιεί κανείς ώριμα ωοκύτταρα, καθώς τα ποσοστά ωρίμανσης είναι σημαντικά χαμηλότερα μετά την υαλοποίηση των ανωρίμων μεinvitroωρίμανση (IVM). Τα IVM-υαλοποιημένα ωοκύτταρα έχουν μικρότερο δυναμικό σε σύγκριση με «φρέσκα» IVMωοκύτταρα.

Ο συνδυασμός της αναρρόφησης ωοκυττάρων από τα θυλάκια του άνδρου της ωοθήκης και ηinvitroωρίμανση είναι μια επιπρόσθετη στρατηγική για την διατήρηση της γονιμότητας.

Αργή ψύξη: Ορισμός και τεχνικές λεπτομέρειες

 Ορισμός

Η τεχνική της αργής ψύξης και της γρήγορης απόψυξης χρησιμοποιείται συχνά για την κρυοσυντήρηση των ωαρίων. Η διαδικασία της ψύξης και της απόψυξης είναι σχεδιασμένη να περιορίζει τη ζημιά που συμβαίνει από τον σχηματισμό παγοκρυστάλλων και από την υψηλή συγκέντρωση διαλύματος (φαινόμενο λύσης) μέσα στα ωάρια.

Οι μέθοδοι της αργής ψύξης και γρήγορης απόψυξης μειώνουν τον σχηματισμό παγοκρυστάλλων και επομένως μειώνουν και  τη ζημία στη δομή των ωαρίων όπως την καταστροφή της μιτωτικής ατράκτου. Ορισμένα πολύ σημαντικά στοιχεία για τη διαδικασία της κρυοσυντήρησης είναι τα χαρακτηριστικά του ωαρίου, η διαπερατότητά του στα κρυοπροστατευτικά μέσα ,η τοξικότητα των μέσων και  η θερμοκρασία και ο χρόνος έκθεσης των ωαρίων  σε αυτά.

Η αποτελεσματικότητα της μεθόδου σχετίζεται αδιάρρηκτα με τα κρυοπροστατευτικά μέσα που χρησιμοποιούνται. Τα κρυοπροστατευτικά είναι ουσίες με υψηλή διαλυτότητα στο νερό και με τοξικότητα ανάλογη με την συγκέντρωση και με τη θερμοκρασία τους. Σε αυτά περιλαμβάνονται αλκοόλες (όπως η μεθανόλη, η αιθανόλη, η προπανόλη, η 1,2 προπανοδιόλη και η γλυκερόλη) , υδατάνθρακες (όπως η γλυκόζη, η λακτόζη, η σακχαρόζη και το άμυλο) καθώς και το διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO). Υπάρχουν δύο είδη κρυοπροστατευτικών μέσων: εκείνα που μπορούν να εισέλθουν στο κύτταρο διαπερνώντας την μεμβράνη του (διαπερατά) και εκείνα που δεν μπορούν (μη διαπερατά).

Συγκέντρωση κρυοπροστατευτικών μέσων και θερμοκρασία ωαρίου

Στα πρωτόκολλα αργής ψύξης μεγάλη σημασία δίνεται στη συγκέντρωση του διαλύματος των κρυοπροστατευτικών μέσων. Η 1,2 προπανοδιόλη (διαπερατό μέσω της κυτταρικής μεμβράνης κρυοπροστατευτικό μέσο) χρησιμοποιείται συνήθως με σακχαρόζη (μη διαπερατό κρυοπροστατευτικό μέσο) σε συγκεντρώσεις 1,5Μ και 0,1-0,3Μ αντίστοιχα. Επίπεδα υψηλής συγκέντρωσης κρυοπροστατευτικών μέσων μπορούν να προκαλέσουν σοβαρή ζημιά στα ωάρια, ειδικά σε θερμοκρασία δωματίου. Και αυτό γιατί το ωάριο σε θερμοκρασία δωματίου κατέχει ακόμα μεταβολικές ιδιότητες και άρα είναι πιο «ευαίσθητο» στην τοξικότητα που προκύπτει από τις κρυοπροστατευτικές ουσίες.

Μια καλή μέθοδος για να αποφευχθεί αυτή η βλάβη είναι να περιορίσουμε την επαφή μεταξύ των κρυοπροστατευτικών μέσων και του ωαρίου σε αυτήν τη θερμοκρασία. Ακόμη και μικρές αλλαγές κατά τη διάρκεια έκθεσης του ωαρίου στα κρυοπροστατευτικά μέσα μπορούν να αλλάξουν το επίπεδο ενυδάτωσής του και άρα την αποτελεσματικότητα της κρυοσυντήρησης.

Υαλοποίηση: Ορισμός και τεχνικές λεπτομέρειες

Η υαλοποίηση έδωσε μια νέα οπτική στην κρυοσυντήρηση των ωαρίων. Είναι μια απλή, γρήγορη και ανέξοδη τεχνική εφόσον γίνεται σε εξειδικευμένα κέντρα. Η υαλοποίηση είναι η διαδικασία στερεοποίησης ενός διαλύματος, κατά την οποία το υγρό ψύχεται τόσο γρήγορα ώστε μετασχηματίζεται από την υγρή σε μια συμπαγή σαν γυαλί κατάσταση σε χαμηλή θερμοκρασία, όχι μέσω της δημιουργίας παγοκρυστάλλων αλλά μέσω της υψηλής αύξησης του ιξώδους κατά την ψύξη.

Για να επιτύχουμε υαλοποίηση στο ενδοκυττάριο νερό του ωαρίου χωρίς τη δημιουργία παγοκρυστάλλων, απαιτείται ψύξη με πολύ γρήγορο ρυθμό (15.000οC/min) και μεγάλες συγκεντρώσεις κρυοπροστατευτικών ουσιών (περίπου 5-7Μ). Μια γρήγορη πτώση της θερμοκρασίας μειώνει το θερμικό στρες του ωαρίου και επομένως περιορίζει μια μεγάλη ζημιά. Η πρώτη γέννηση από ώριμο ωάριο που υπέστη υαλοποίηση καταγράφηκε το 1999, σε πρωτόκολλο στο οποίο  χρησιμοποιήθηκε μεγάλη συγκέντρωση αιθυλενογλυκόλης 5,5 mol/l και σακχαρόζης 1 mol/l.

Τρεις είναι οι παράγοντες που επηρεάζουν την πιθανότητα επιτυχούς υαλοποίησης: ο ρυθμός ψύξης, το ιξώδες και ο όγκος του διαλύματος. Είναι κοινώς αποδεχτό ότι αυξάνοντας το ιξώδες και τον ρυθμό ψύξης ή μειώνοντας τον όγκο του διαλύματος, αυξάνουμε την πιθανότητα υαλοποίησης.

Σχεδόν όλες οι τεχνικές υαλοποίησης βασίζονται στην άμεση επαφή ανάμεσα στο διάλυμα των κρυοπροστατευτικών ουσιών και του υγρού αζώτου. Χρησιμοποιείται το υγρό άζωτο καθώς η άμεση τοποθέτηση του ωαρίου σε αυτό είναι ο πιο εύκολος τρόπος για να μειωθεί η θερμοκρασία αλλά το μέγεθος που απαιτείται για το σταγονίδιο που περιέχει το κύτταρο σε αυτήν την περίπτωση είναι σχετικά μεγάλο (5-6 mcm τουλάχιστον) και ο ρυθμός ψύξης μπορεί να είναι έτσι μικρότερος από τον επιθυμητό λόγω του ότι το σταγονίδιο επιπλέει στην επιφάνεια του υγρού αζώτου πριν βυθιστεί.

Για αυτόν τον λόγο  χρησιμοποιήθηκαν πρωτότυπα κρυοδοχεία που επιτρέπουν την άμεση επαφή ανάμεσα στο υγρό άζωτο και το διάλυμα που περιέχει το ωοκύτταρο και έχουν ως κοινό μια μεγάλη αναλογία επιφάνειας – όγκου. Αυτή η τεχνική της πολύ γρήγορης ψύξης πρέπει να ακολουθείται από πολύ γρήγορη απόψυξη για να αποτραπεί η επανακρυσταλλοποίηση των παγοκρυστάλλων.

Μειώνοντας τον όγκο του διαλύματος, μειώνουμε την πιθανότητα του σχηματισμού των παγοκρυστάλλων και επιτρέπουμε την επιτυχημένη υαλοποίηση χρησιμοποιώντας χαμηλά (και μη τοξικά) συμπυκνωμένα διαλύματα υαλοποίησης. Επομένως, τα τελευταία συστήματα/όργανα είναι σχεδιασμένα να αυξάνουν το ρυθμό ψύξης χρησιμοποιώντας φορείς ελάχιστου όγκου.

Στα συστήματα αυτά περιλαμβάνονται τα open pulled straws  (OPS), εύκαμπτα σιφώνια (flexipet-denunding pipettes), οι ελάχιστου μεγέθους σταγόνες (micro-drops), το πλέγμα ηλεκτρονικού μικροσκοπίου (electron microscopic copper grids), το hemi-straw system, το νάιλον πλέγμα ή cryoloop ή άλλες μέθοδοι.

Ο ακριβής ρυθμός ψύξης κατά τη διάρκεια της υαλοποίησης, επομένως και  η αποτελεσματικότητά του, μπορεί να διαφέρει πολύ καθώς εξαρτάται από την συσκευή που χρησιμοποιούμε, την εξειδίκευση του προσωπικού ακόμη και την συγκεκριμένη κίνηση κατά το βύθισμα του φορέα στο υγρό άζωτο.

Σύγχρονες τάσεις κρυοσυντήρησης

Ι. Βελτίωση της αργής ψύξης

Αντικατάσταση με χολίνη

Η αντικατάσταση αυτή του χλωριούχου νατρίου με χολίνη στα μέσα κρυοσυντήρησης εμφανίζεται να βελτιώνει το αποτέλεσμα της κρυοσυντήρησης και για αυτό τώρα δοκιμάζεται σε κλινικές δοκιμές, παραμένει όμως να αξιολογηθεί πλήρως.

Η χολίνη είναι ένα σύνθετο συστατικό που είναι απαραίτητο για τη φωσφολιπιδική  βιοσύνθεση και την σηματοδότηση των κυττάρων. Σε αντίθεση με το ιόν νατρίου, η χολίνη δεν θεωρείται ότι διαπερνά την μεμβράνη. Επομένως, δεν περιμένουμε να συμβάλει στην ενδοκυτταρική τοξικότητα ή ωσμωτική πίεση.

Τρεχαζόλη ως κρυοπροστατευτική ουσία

Μια άλλη πρόσφατη τάση ως προς την μέθοδο αργής ψύξης του ωαρίου για κρυοσυντήρηση εμπλέκει την χρήση της ζάχαρης τρεχαλόζης ως κρυοπροστατευτική ουσία.Η έγχυση ζάχαρης(τρεχαλόζη) στα ωάρια μπορεί να σταθεροποιήσει τις μεμβράνες κατά τη διάρκεια της ψύξης.

Συγκεντρώσεις κρυοπροστατευτικών ουσιών

Στην κρυοσυντήρηση των ωαρίων, η προπανοδιόλη είναι η πιο κοινή χρησιμοποιούμενη κρυοπροστατευτική ουσία σε συγκέντρωση , συνήθως, 1,5mol/l, συγκέντρωση πολλές φορές μεγαλύτερη από οποιοδήποτε άλλο συστατικό στο μέσο.Για αυτό οι κρυοπροστατευτικές ουσίες εισέρχονται στο κύτταρο μέσω της διαδικασίας της ώσμωσης  έχοντας ως αποτέλεσμα νερό να διαπερνά ακόμα περισσότερο την κυτταρική μεμβράνη όπως περιγράψαμε πριν.

Σε πρωτόκολλα ψύξης των ωαρίων χρησιμοποιείται 1,2 προπανοδιόλη (PROH, κρυοπροστατευτική ουσία που διαπερνά την κυτταρική μεμβράνη) σε συνδυασμό με μια σακχαρόζη (που δεν διαπερνά τη μεμβράνη) σε ποικίλες συγκεντρώσεις από 0,1-0,2 και 0,3 Μ.

Χρόνος έκθεσης για κρυοπροστατευτικές ουσίες

Η Κατά τη διάρκεια της φάσης ψύξης και απόψυξης, οι αλλαγές ενός ή δύο λεπτών, στην προηγουμένως χρησιμοποιούμενη διάρκεια έκθεσης στα κρυοπροστατευτικά μέσα, παρατηρήθηκε ότι επιδρούν δραστικά στο μέγεθος του κυττάρου με τις ανάλογες συνέπειες. Σε περιπτώσεις σημαντικά μεγάλης έκθεσης των ωαρίων στα κρυοπροστατευτικά μέσα ,η μιτωτική τους άτρακτος υφίσταται σοβαρές αλλαγές.

Μετάβαση φάσης της λιπιδικής μεμβράνης (LPT)

Μια άλλη σύγχρονη τάση για τη βελτίωση της κρυοσυντήρησης με τη μέθοδο της αργής ψύξης μελετήθηκε πρόσφατα. Σε αυτήν τη μελέτη υπογραμμίζεται η σημασία της θερμοκρασίας  μετάβασης φάσης της μεμβράνη λιπιδίων για το μέλλον ενός κυττάρου κατά τη διάρκεια της φάσης της ψύξης.

Η LPT ορίζεται ως η θερμοκρασία στην οποία η μεμβράνη φωσφολιπιδίων μετατρέπεται από υγρή κρυστάλλινη φάση σε gel  κρυστάλλινη φάση. Με άλλα λόγια, η σύνθεση λιπιδίων της μεμβράνης είναι άμεσα συνδεδεμένη με την ικανότητα του κυττάρου να υποστεί ενα θερμικό στρες.

Επομένως η υψηλή LPT θερμοκρασία των ωαρίων πιστεύεται ότι είναι η αιτία για το μικρό ποσοστό επιβίωσης κατά τη διάρκεια της διαδικασίας της κρυοσυντήρησης.

Ποιότητα ωαρίων

  1. Η ωριμότητα των ωαρίων

Είναι γενικώς αποδεκτό ότι το ποσοστό επιβίωσης  εξαρτάται από την ποιότητα των καταψυγμένων ωαρίων. Σε μια έρευνα ώριμων ωαρίων πολύ καλής ποιότητας αναφέρθηκε ποσοστό επιβίωσης 76% σε αντίθεση με το χαμηλότερο ποσοστό επιβίωσης που είχε άλλη έρευνα σε μεγάλο αριθμό ωαρίων, που ήταν συνήθως χαμηλής ποιότητας και συνάμα ανώριμα, αποδεικνύοντας μια πιθανή σχέση ανάμεσα στην ποιότητα και τα ποσοστά επιβίωσης των ωαρίων της κρυοσυντήρησης και της ωριμότητας των ωαρίων.

  1. Ο ρόλος της GnRH

Έπειτα από τις πρόσφατες έρευνες, η χρήση GnRH αγωνιστών  ή GnRH ανταγωνιστών  σε επαναλαμβανόμενους κύκλους συλλογής ωαρίων, δεν οδηγεί σε διαφορετικά αποτελέσματα για μεταφορές ωοκυττάρων που έχουν υποστεί κρυοσυντήρηση.

Ενδοκυτταροπλασματική έγχυση σπέρματος (ICSI)

Υπάρχουν ορισμένες ομάδες που από την πρώτη εφαρμογή της ICSI,  έχουν αναφέρει βελτιωμένα ποσοστά επιβίωσης και γονιμοποίησης με την χρήση ICSI.

ΙΙ. Βελτιώσεις υαλοποίησης

Μέθοδοι ελάχιστου όγκου

Λόγω του περιορισμένου ρυθμού θερμικής αλλαγής των συμβατικών πιπετών, χρησιμοποιήθηκαν στο παρελθόν περισσότερο συμπυκνωμένα κρυοπροστατευτικά μέσα, με αποτέλεσμα τοξικές επιδράσεις στο ωοκύτταρο. Χρησιμοποιώντας μεθόδους ελάχιστου όγκου, μπορούμε να επιτύχουμε υψηλότερους ρυθμούς ψύξης κατα την υαλοποίηση και υψηλότερους ρυθμούς θέρμανσης κατά την απόψυξη με λιγότερο συμπυκνωμένα κρυοπροστατευτικά μέσα.

Πρόσφατες μελέτες δείχνουν οτι το κλειστό σύστημα είναι τόσο αποτελεσματικό όσο η συνηθισμένη μέθοδος υαλοποίησης με σύστημα ανοιχτών φορέων.

Σταδιακή ισορρόπηση των κρυοπροστατευτικών μέσων

Τέλος, η σταδιακή ισορρόπηση των κρυοπροστατευτικών μέσων είναι μια πρόσφατη τάση του κόσμου της υαλοποίησης απέναντι στη μείωση των τοξικών επιδράσεων του διαλύματος υαλοποίησης στα ωάρια. Αρχικά, η διαδικασία υαλοποίησης ενός βήματος, με ωάρια που δεν είχαν προετοιμαστεί προηγουμένως με ένα διάλυμα ισορρόπησης είχε ως αποτέλεσμα ένα ανεπαρκώς διαπερατό ωάριο από κρυοπροστατευτικές ουσίες. Με την στρατηγική των δύο βημάτων της σταδιακής ισορρόπησης αυτό αποφεύγεται. Υπάρχουν αναφερόμενες εφαρμοσμένες διαδικασίες όχι μόνο σε θερμοκρασία δωματίου αλλά και στους 35-37οC.

Αργή ψύξη και υαλοποίηση

ΠΟΣΟΣΤΑ ΑΡΓΗΣ ΨΥΞΗΣ ΜΕΧΡΙ ΤΟ 2004

Τα δεδομένα για την αργή ψύξη, σε αντίθεση με αυτά της υαλοποίησης, είναι αρκετά για να συμπεράνουμε ότι υπάρχει μια σταδιακή βελτίωση στην αποτελεσματικότητα της κρυοσυντήρησης ωαρίων με την πάροδο του χρόνου, με το ποσοστό των γεννήσεων υγιών παιδιών να αυξάνεται από 21,6% ανά μεταφορά μεταξύ 1996-2004 σε 32,4% το διάστημα 2002-2004.

Τα δεδομένα της υαλοποίησης ακολούθησαν μια παρόμοια τάση, με ποσοστό πραγματικών γεννήσεων και κυήσεων να αυξάνεται από 29,4% πριν από το 2005 στο 39% μετά το 2005, Στην αρχή το ποσοστό των αυτόματων αποβολών που παρατηρήθηκε μετά από κρυοσυντήρηση ωαρίων ήταν αξιοσημείωτα υψηλό προβληματίζοντας πολύ τους επιστήμονες. Παρόλα αυτά, στα χρόνια που ακολούθησαν εμφανίστηκε μια τάση μείωσης του ποσοστού αυτού.

ΠΟΣΟΣΤΑ ΥΑΛΟΠΟΙΗΣΗΣ ΜΕΧΡΙ ΤΟ 2006

Σύμφωνα ακόμη με πρόσφατη μετα-ανάλυση τα ποσοστά εγκυμοσύνης με υαλοποίηση μοιάζουν να έχουν βελτιωθεί δραματικά, ειδικά μετά το 2005. Το ποσοστό γονιμοποίησης, το ποσοστό των πραγματικών κυήσεων ανά εγχυμένο ωάριο και το ποσοστό των κλινικών κυήσεων ανά κύκλο (σε όλες τις έρευνες χρησιμοποιήθηκαν ώριμα ωάρια) ήταν 74,2%, 4,5% και 45,5% αντίστοιχα και ο μέσος όρος του ποσοστού των ζωντανών γεννήσεων ανά κύκλο ήταν 36,6%.

Ακόμη είναι φανερό ότι μετά την προσθήκη των περιστατικών που αναφέρθηκαν μετά τον Ιούνιο του 2005, υπήρξε μια αύξηση στο ποσοστό των κυήσεων (από 29,4% σε 51%) το οποίο κατά τη γνώμη μας υποστηρίζει τον πολλά υποσχόμενο ρόλο της υαλοποίησης των ωαρίων στη διατήρηση της γονιμότητας . Μεγάλη προσοχή πρέπει να δοθεί στο γεγονός ότι τα ποσοστά αποβολής είναι πολύ χαμηλά πλέον.

ΤΑ ΤΕΛΕΥΤΑΙΑ ΠΟΣΟΣΤΑ ΕΠΙΒΙΩΣΗΣ ΚΑΙ ΚΥΗΣΗΣ ΤΩΝ ΔΥΟ ΜΕΘΟΔΩΝ

Στον Πίνακα 1 παρουσιάζουμε συγκριτικά αποτελέσματα που συγκρίνουν τις δύο μεθόδους:

Ο Θοδωρής Καλαμπόκας στην Πελίνα Θεοδοσίου για την κατάψυξη ωαρίων, ως μέσο διατήρησης της γονιμότητας της γυναίκας (video).

 

 

Last update: 15/05/23